L'Imperial Regia Biblioteca di Mantova fu aperta al pubblico il 30 marzo 1780, in conformità con il vasto programma di laicizzazione e riforma delle istituzioni culturali ed educative varato nel 1749 da Maria Teresa d'Austria. Alla politica illuminata dell'impero asburgico corrispose infatti, in area lombarda, la fondazione di una struttura omogenea di biblioteche pubbliche ordinate sul territorio, quasi sempre negli edifici conventuali della Compagnia di Gesù, soppressa nel 1773, con al vertice la Biblioteca Pertusati di Milano, che nel 1786 assunse il nome di Braidense, e la Biblioteca Universitaria di Pavia. Nello stesso scorcio vedevano quindi la luce sul territorio lombardo la Biblioteca di Cremona e, di poco successive, quelle di Como e Lodi.
La nascita e lo sviluppo originario della Biblioteca può tuttavia essere compreso appieno solo considerando l'intreccio di relazioni con altre istituzioni culturali cittadine, topograficamente contigue e contestualmente ridisegnate dagli Asburgo. Ci si riferisce in particolare alla Reale Accademia di Scienze e Belle Lettere (dal 1981 Accademia Nazionale Virgiliana di Scienze, Lettere e Arti), che rappresentò il nuovo organo di riferimento per l'istruzione superiore cittadina dopo la soppressione dell'Università degli studi gesuitica, avvenuta nel 1760: la Biblioteca fu infatti fondata quale istituto sussidiario per lo studio e la ricerca rispetto all'Accademia e al liceo-ginnasio, e fino a oltre la metà dell'Ottocento questi tre istituti ebbero una gestione comune.
Gli ambienti iniziali adibiti a Biblioteca corrispondono alle sale ora denominate prima e seconda teresiana del gesuitico Palazzo degli Studi, tra loro unite da un ampio vestibolo. Nei primi anni furono acquisiti e messi a disposizione del pubblico volumi dell'Accademia, del collegio gesuitico, dei soppressi conventi di carmelitani e certosini e librerie ottenute per donazioni e lasciti di privati. Grazie a una dotazione annua e a stanziamenti straordinari dell'amministrazione asburgica furono inoltre acquistate opere d'interesse soprattutto naturalistico, come la collezione dello scienziato svizzero, di lingua tedesca, Albrecht von Haller, ripartita tra diversi istituti della Lombardia austriaca. Una politica di ridistribuzione di duplicati (1778-1783) permise quindi di ottenere circa 13.000 volumi, provenienti dalle biblioteche di Vienna, Cremona e dalla Braidense.
Durante il periodo francese (1797-1799, 1801-1814) nuove soppressioni monastiche comportarono l'arrivo da tutta la provincia dei preziosi patrimoni bibliografici dei conventi di San Benedetto in Polirone, di Santa Maria delle Grazie, di agostiniani, domenicani, francescani e cappuccini. Si stima che il patrimonio sia progressivamente aumentato dalla iniziale dotazione di circa 6.000 volumi ai circa 40.000 del 1823.
Nel periodo della Restaurazione gli avvenimenti politici e la pesante censura instaurata dal governo austriaco inibirono la vita culturale della città. Tra i fatti degni di menzione che coinvolsero la Biblioteca si ricordano la restituzione, avvenuta nel 1816, dei manoscritti trafugati dai francesi, l'acquisto nel 1824 del fondo dei manoscritti di Leopoldo Camillo Volta (proto prefetto della Biblioteca quasi ininterrottamente dal 1779 al 1823) e nel 1838 della raccolta completa della "Gazzetta di Mantova".
Con l'annessione di Mantova al Regno d'Italia, avvenuta nel 1866, la Biblioteca divenne governativa (statale). Sul finire del secolo essa fu positivamente investita dal clima di partecipazione e dalla relativa vivacità intellettuale che rianimarono la città, e attorno ad essa si polarizzò l'interesse di amministratori e di esponenti della cultura locale, che ne patrocinarono il passaggio all'amministrazione comunale avvenuto nel 1881. Essa acquisì pertanto altri doni e lasciti nel frattempo concessi al Comune. All'inizio del Novecento la Biblioteca, il cui patrimonio librario era arrivato a circa 120.000 volumi, si estese al lungo corridore del primo piano, che per tutto il secolo precedente era stato adibito a museo statuario. Nel 1912 un primo segnale di mutamento rispetto al carattere elitario dell'istituto della biblioteca pubblica, che in Europa perdurò fino al primo ventennio del secolo scorso e in Italia oltre il secondo conflitto mondiale, fu l'apertura al piano terra del Palazzo degli Studi di via Ardigò della sezione "Biblioteca Popolare", aperta per sei mesi all'anno (da novembre ad aprile) nella fascia oraria serale per consentire l'affluenza dei lavoratori, nel 1915 trasferita a Palazzo Aldegatti. Nel 1930 fu siglata una convenzione che permise il deposito della preziosa biblioteca della Comunità ebraica di Mantova.
Nel 1952 il patrimonio librario fu stimato in 200.000 volumi. Nel 1959, in occasione del completamento del restauro dell'edificio voluto dal sindaco Eugenio Dugoni, venne allestita la mostra dei Libri stampati a Mantova nel secolo XV e dei cimeli di Baldassarre Castiglione. Nel 1966 un'altra importante esposizione, la Mostra dei codici gonzagheschi, segnò il temporaneo ritorno a Mantova di importanti manoscritti appartenuti alla libreria dei Gonzaga, ora sparsi in varie biblioteche italiane ed estere. Dal 1992 la Biblioteca fa parte del polo di Lombardia Informatica di SBN, il Servizio Bibliotecario Nazionale, che consente la catalogazione partecipata on-line tra tutte le biblioteche aderenti, nonché una condivisione delle risorse informative tramite il prestito interbibliotecario.